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mCheery Nanobody Agarose Beads
  • 产品货号:
    BN20547
  • 中文名称:
    mCheery Nanobody Agarose Beads
  • 货号

    产品规格

    售价

    备注

  • BN20547-500ul/25T

    500ul/25T

    ¥2800.00

  • BN20547-1ml/50T

    1ml/50T

    ¥5200.00

产品描述:偶联 anti-mCherry 纳米抗体的琼脂糖珠用于免疫沉淀 mCherry 融合蛋白。 

产品优势 

     没有普通抗体的轻链和重链; 

     高亲和力:解离常数达 nM-pM 级别; 

     高载量:20 ul 的 beads 悬液可以结合 2-10 ug mCherry 蛋白; 

     较短的孵育时间,结合 30-120 min 即可; 

应用范围 

     可用于免疫沉淀(IP)/免疫共沉淀(CoIP)、染色质免疫沉淀(ChIP)/RNA 结合蛋白免疫沉淀(RIP)、 酶活性测定、质谱分析等; 

特异性 

     可以结合 mCherry,也可能结合 RFP,DsRed 等红色荧光蛋白。 

产品特性 

     存储缓冲液:PBS(含有 20%乙醇)。 

     保存条件:可在 4℃保存至少 1 个月,在-20 度或-80℃保存2 年,避免高速离心,干燥和反复冻融。 

实验原理

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实验步骤: 

收集细胞:

     每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞(约一个 10 厘米培养皿)表达绿色荧光蛋白融合蛋白。吸出生长培养 基、向培养皿中加入 2 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次,利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞,细胞转移到离心管, 500 g 离心 3-5 分钟并丢弃上清液。

细胞裂解: 

     1.用 500 ul 预冷的裂解缓冲液重悬细胞,在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂(自备)。对于膜蛋白或核/染色质蛋白, 可使用 RIPA 裂解液(货号:BN25012)中加入蛋白酶抑制剂(货号:BN25002)。 

     2.把离心管放置在冰上 30 分钟,可以每 10 分钟充分吹打一次。 

     3.细胞裂解产物在 4℃,20,000 g 条件下离心 15 分钟,转移裂解产物到一个新的预冷管中,丢弃沉淀。注意:此时细胞 裂解产物可以放在-80℃进行长期储存。

平衡珠子: 

     4.振荡混匀 mCherry-Nanobody-Agarose Beads 悬液,吸取 20ul beads 悬液到 500 ul 预冷的裂解缓冲液中,在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心 3 分钟,丢弃上清液。(此步骤可选) 

结合蛋白

     5. 将细胞裂解产物加入到平衡的 mCherry-Nanobody-Agarose Beads 悬液中(如果未做第 4 步,可在细胞裂解产物中直 接加入 20ul beads 悬液),在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 30-120 min。如果需要,保存 50 ul 的裂解产物进行免疫 印迹分析。 

     6. 在 4 ℃,2,500 g 条件下离心 3 分钟,丢弃上清液。

清洗珠子: 

     7. 用 500 ul 预冷的裂解缓冲液中洗涤 mCherry-Nanobody-Agarose Beads 悬液,在 4 ℃,2,500 g 条件下离心 3 分钟, 丢弃上清液并重复洗涤 2 次。(可选:在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM)。 

洗脱蛋白:

方法一: 

     8. 加入 20ul 2X SDS-sample buffer 重悬 mCherry-Nanobody-Agarose Beads 悬液。在 95℃条件下加热 10 min,把免 疫沉淀复合物从珠子上游离出来,然后在 4 ℃,2,500 g 条件下离心 3 分钟收集上清,进行免疫印迹分析。 

方法二:

     9. 替代步骤 8 的可选步骤:加入 50ul 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白,建议孵育时间 30 秒,并不断混匀,随后 离心,转移上清液到新管中,为了中和酸性的甘氨酸,需添加 5ul 1.0 M Tris(pH10.4)。注意:为了提高洗脱效率可 以重复这一步。 

产品效果:

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